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簡(jiǎn)介
Periostin（POSTN、PN或成骨細(xì)胞特異性因子OSF-2）是一種蛋白質(zhì)，由POSTN基因編碼，Periostin作為α-V/β-3和α-V/β-5整合素的配體，支持上皮細(xì)胞的粘附和遷移，骨膠原蛋白是一種釉質(zhì)結(jié)構(gòu)的維生素K依賴性因子，它是一種分泌型細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，最初在間質(zhì)系細(xì)胞（成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞衍生的細(xì)胞、牙周韌帶和骨膜）中被發(fā)現(xiàn)，它與癌癥中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及發(fā)育中的心臟中的間質(zhì)分化有關(guān)，該蛋白與昆蟲中的分泌型細(xì)胞粘附分子Fasciclin I有同源性，在許多癌癥中，periostin與癌細(xì)胞上的整合素結(jié)合，激活A(yù)kt/PKB和FAK介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，這導(dǎo)致了細(xì)胞存活率、侵襲、血管生成、轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的增加，在人類和小鼠中，periostin在其C端區(qū)域進(jìn)行替代剪接，產(chǎn)生特定的異構(gòu)體，可在廣泛的癌癥中觀察到，如胰腺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌，雖然骨膠原蛋白在組織發(fā)育和疾病中發(fā)揮著廣泛的作用，但它在組織重塑中作為對(duì)損傷的反應(yīng)的功能是這些不同機(jī)制中共同的基本作用，在細(xì)胞命運(yùn)的變化過程中，無論是與生理學(xué)的改變還是與病理變化有關(guān)，圍巖蛋白都會(huì)暫時(shí)性地上調(diào)，它影響細(xì)胞外基質(zhì)的重組、組織重塑和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，所有這些都可能與組織愈合、發(fā)育和疾病有關(guān)，因此，它的功能是作為一個(gè)調(diào)解人，平衡對(duì)組織損傷的適當(dāng)和不適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)。
檢測(cè)原理
本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù) : 將捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上，捕獲樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中的待測(cè)物POSTN，清洗后，再加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體進(jìn)行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測(cè)抗體”免疫復(fù)合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進(jìn)行孵育，待孵育結(jié)束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測(cè)物則顯藍(lán)色，加入終止液停止反應(yīng)。檢測(cè)過程中游離的成分均被洗去，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)OD值，顏色的深淺和樣品中的待測(cè)物的含量呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中POSTN的濃度。
需要的其他材料
1. 酶標(biāo)儀，包含450nm測(cè)定波長(zhǎng)，同時(shí)包含600-680nm校正波長(zhǎng)更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排槍或自動(dòng)微孔板清洗機(jī)；
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。
樣品保存
樣品收集后若在 1 周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），避免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
試劑準(zhǔn)備工作
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標(biāo)準(zhǔn)品配置
試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個(gè)試管，先從60ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至3000pg/mL（例：50μL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的3000pg/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在6個(gè)試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個(gè)單獨(dú)的試管中將3000pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品依次2倍倍比稀釋至6個(gè)梯度，共配制7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為: 3000pg/mL、 1500pg/mL、 750pg/mL、 375pg/mL、 187.5pg/mL、 93.75pg/mL、 46.88pg/mL，從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取500μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個(gè)試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0pg/mL)。
抗體工作液配置
使用前10分鐘，將100×生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液，根據(jù)所需用量當(dāng)日配置當(dāng)日使用。
酶結(jié)合物工作液配置
使用前10分鐘，將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液，根據(jù)所需用量配置。
備 注：如待測(cè)樣POSTN度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。
結(jié)果的計(jì)算
計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時(shí)去掉空白組的值)?；蛘呤褂媚軌蛏伤膮?shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件來創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
示例數(shù)據(jù)
標(biāo)準(zhǔn)品濃度(pg/mL)
3000
1500
750
375
187.5
93.75
46.88
0
OD值
2.547
1.637
1.099
0.713
0.473
0.279
0.141
0.059
校正OD值
2.488
1.578
1.04
0.654
0.414
0.22
0.082
0
以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
下圖所示標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供示例，結(jié)果計(jì)算應(yīng)以同次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線為準(zhǔn)計(jì)算樣本結(jié)果
重復(fù)性
板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。
靈敏度
經(jīng)樣本測(cè)試，本試劑盒的檢測(cè)靈敏度23.44pg/mL。
特異性
該試劑盒測(cè)定可識(shí)別重組小鼠POSTN。
其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測(cè)定交叉反應(yīng)性。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。
使用ELISA試劑盒之前，請(qǐng)您必須完整閱讀說明書，本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于臨床診斷和治療。
