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品質(zhì)保證 · 通蔚試劑

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產(chǎn)品中心

  • 副流感病毒1型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

    規(guī)格：
    • 品牌 : 通蔚生物
    • 目錄號 : TW37032
    • 應(yīng)用 : 僅供科研使用
    • 貨期 : 現(xiàn)貨
    • 規(guī)格 ：50次
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產(chǎn)品及特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)副流感病毒1型高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他病毒的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分：

編號

成分

規(guī)格

試劑一

探針法 qRT-PCR 緩沖液

500 μL（藍蓋）

試劑二

探針法 qRT-PCR 酶混合液

100 μL（紅蓋）

試劑三

熒光 PCR 專用模板稀釋液

1 mL（黃蓋）

試劑四

副流感病毒1型探針法qRT-PCR引物混合液

100 μL（白蓋）

試劑五

副流感病毒1型 qRT-PCR 探針

50 μL（棕色管）

試劑六

副流感病毒1型探針法qRT-PCR陽性對照(1×10E8/μL)

50 μL（黃蓋）

使用手冊

1 份

運輸及保存：
低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。
自備試劑：
樣品 RNA。
使用方法：
一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）：
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 RNA 的制備：
7. 如果有 N 個樣品，最好設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。
三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進行）：
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

成份

樣品管N+2個

RT-PCR陰性對照管

標準曲線樣品管

(2-7管)

探針法 qRT-PCR 緩沖液

各 10 μL

10 μL

各 10 μL

探針法 qRT-PCR 酶混合液

各 2 μL

2 μL

各 2 μL

副流感病毒1型 qRT-PCR 探針

各 1 μL

1 μL

各 1 μL

副流感病毒1型探針qRT-PCR引物混合液

各 2 μL

2 μL

各 2 μL

待測樣品 RNA 模板

各 5 μL

--

--

超純水

--

5 μL

--

第7步所得標準曲線樣品稀釋液2-7號

不加

不加

各5 μL (2號樣到2號管，3號樣到3號管)

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 qRT-PCR：

過程

溫度

時間

逆轉(zhuǎn)錄

50℃

30 min

預(yù)變性

94℃

10 min

qRT-PCR反應(yīng)35個循環(huán)

94℃

15 sec

60℃

1 min，(采集FAM通道的熒光信號)

四、數(shù)據(jù)處理：
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
五、特別提示：
本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！