早期的PCR技術(shù)雖然具有突破性意義，但也存在一些局限性，促使科研人員不斷努力開發(fā)新的PCR酶和設備。本文主要圍繞酶發(fā)展史，介紹早期PCR存在的問題，以及克服這些問題的新型PCR酶的開發(fā)。

    早期PCR存在的問題

    最初，DNA聚合酶I的Klenow片段用于在PCR中擴增DNA。然而，這種酶在高溫下不穩(wěn)定，在PCR每次循環(huán)的熱變性步驟中失去活性。此外，延伸反應必須在低溫（+37°C）下進行。由于這些原因，早期的PCR存在以下問題并且不太方便：

    對于實驗者來說非常繁瑣（每個循環(huán)添加Klenow酶是一項繁瑣且重復的任務）

    昂貴（由于使用了大量Klenow酶）

    存在非特異性擴增的可能性（在+37°C時，引物與DNA的非目標區(qū)域結(jié)合，擴增非特異性區(qū)域）

    此外，該技術(shù)每次添加新的酶時都需要打開試管，容易受到污染；研究人員必須在整個反應過程中保持在場，這限制了他們一次可以處理的樣本數(shù)量；并且PCR過程無法輕易實現(xiàn)自動化。

    解決上述問題需要很長時間的研究。在此過程中，新的PCR酶和設備正在開發(fā)中。下面我們就來看一下它的歷史。

    PCR酶發(fā)展史

    科研人員對耐熱DNA聚合酶的分離和鑒定，使得通用PCR技術(shù)成為可能。TaqDNA聚合酶穩(wěn)定，在PCR所用的高溫（約+72°C）延伸反應條件下表現(xiàn)出最佳活性。TaqDNA聚合酶在PCR重復循環(huán)過程中保持穩(wěn)定，因此無需在每次循環(huán)后停止PCR并添加更多酶（Saiki等人，1988）。

    從那時起，人們進行了各種改進，從而開發(fā)出更準確、更方便的PCR酶。

    1989

    DavidGelfand和SusanneStroffel（當時在Cetus公司，后來在羅氏分子診斷公司）于1986年純化了天然Taq酶。勃林格曼（現(xiàn)為羅氏）是供應重組Taq酶的公司之一。

    然而，TaqDNA聚合酶仍有改進的空間。首先，該酶缺乏校對活性，無法糾正擴增過程中發(fā)生的轉(zhuǎn)錄錯誤（潛在突變）。在大多數(shù)擴增反應中，這些偶然發(fā)生的突變并不是什么大問題。然而，對于某些應用（例如擴增基因組DNA以進行測序或等位基因多態(tài)性研究），任何轉(zhuǎn)錄錯誤都可能導致錯誤的結(jié)果。

    具有校對活性的耐熱DNA聚合酶的發(fā)布解決了這個問題，使得需要高度精確的轉(zhuǎn)錄反應的應用能夠?qū)崿F(xiàn)高保真PCR。

    1994

    PwoDNA聚合酶是一種具有校對活性的耐熱酶，由勃林格曼公司（后來的羅氏公司）于1994年發(fā)布。

    提高反應保真度的另一種方法是將TaqDNA聚合酶與耐熱酶（例如，TgoDNA聚合酶）或其他具有校對活性的蛋白質(zhì)相結(jié)合。

    1995

    目前已有一款這樣的酶混合物——ExpandHighFidelityPCRSystem——上市。

    使用酶混合物代替單一酶為PCR提供了重要的優(yōu)勢，包括校對活性以及擴增更長靶標的能力（Barnes，1994）。

    1996

    經(jīng)過進一步改進以優(yōu)化反應，發(fā)布了用于擴增長達20kb的目標的酶混合物（擴展長模板PCR系統(tǒng)，于1994年推出）。隨后，一種新的酶混合物被發(fā)布，它能夠擴增長達35kb的目標（Expand20kbPLUSPCRSystem，于1996年推出）。

    改良的TaqDNA聚合酶可實現(xiàn)“熱啟動PCR”，該PCR在室溫下不活躍，但在DNA變性溫度下容易被激活（Birch等人，1996年）。這將最大限度地減少麻煩的引物二聚體的形成。

    2000年，FastStartTaqDNA聚合酶

    作為“熱啟動PCR”應用產(chǎn)品推出(2000)。通過在其酶混合物（FastStart高保真PCR系統(tǒng)，于2003年推出）中添加FastStartTaqDNA聚合酶，羅氏創(chuàng)建了一個能夠滿足多重PCR和高保真熱啟動PCR等苛刻應用的系統(tǒng)。

    以上我們介紹了PCR酶的發(fā)展和歷史。這樣發(fā)展起來的新型PCR技術(shù)現(xiàn)在不僅應用于基礎研究，還應用于醫(yī)療實踐、食品檢測和刑事調(diào)查等多個領域。